编辑: glay | 2015-04-06 |
932 Hereditas (Beijing)
2017 第39 卷1材料和方法 1.1 材料 电转仪 ECM?
830 购自美国 BTX 公司;
电转仪 Nucleofector? 2b 购自德国 LONZA 公司;
NEPA21 购自日本 NEPA GENE 公司.PFFs 细胞由广东温氏 食品集团股份有限公司提供;
质粒 pPB-UBC-EGFP (7.6 kb)由英国 Wellcome Trust Sanger Institute 提供. Opti-MEM? ⅠReduced Serum Medium 购自 Thermo Fisher Scientific(美国);
Nucleofector? 2b 电转液 Basic Nucleofector Kit for Primary Mammalian Fi- broblasts 购自德国 Amaxa 公司;
Endo-free Plasmid Maxi Kit 购自美国 Omega;
FastDigest? NotⅠ限制性 内切酶购自 Thermo Fisher Scientific(美国);
澳洲胎 牛血清(fetal bovine serum, FBS)购自 Gibco(美国);
Countess? II FL 全自动细胞计数仪购自 Life invi- trogen(美国). 1.2 方法 1.2.1 质粒准备 pPB-UBC-EGFP 依照 Endo-free Plasmid Maxi Kit 说明书进行抽提, 取部分超螺旋 pPB-UBC-EGFP 质粒 DNA, 用FastDigest? NotⅠ限制性内切酶酶切, 纯化回收, 制备线性化的 pPB-UBC-EGFP 质粒 DNA 备用. 1.2.2 PFFs 电转染步骤及检测方法 PFFs 细胞经解冻和复苏培养后,传代至含
10 mL 完全培养基(12%FBS)的10 cm 培养板, 于39℃、 5%CO2 培养箱中培养至汇合度达 80%~90%,经0.05%胰酶 消化后进行细胞计数.吸取 1*106 个细胞悬液至新 的离心管中,离心后弃上清,分别根据表
1 中处理 组1和处理组
2 对应的电转仪添加相应的电转预混 液, 制成单细胞悬液(空白组仅添加
100 μL 相应体积 的电转液和水,不电转)转至
2 mm 间距的无菌电转 杯中,根据不同仪器设定的电转参数进行电转.然表1实验分组情况 Table
1 Experimental groups 组别 电转仪 电转预混液 处理组
1 NEPA
100 μL NEPA 电转液+质粒 空白组
1 不电转
100 μL NEPA 电转液和水 处理组
2 LONZA
100 μL LONZA 电转液+质粒 空白组
2 不电转
100 μL LONZA 电转液和水 注:NEPA 代表 NEPA 21;
NEPA 电转液为无血清 Opti-MEM;
LONZA 代表 Nucleofector? 2b;
LONZA 电转液由电转试剂盒 Basic Nucleofector Kit for Primary Mammalian Fibroblasts (Amaxa, 德国)中Nucleofector? Solution 和supplement(4.5:1)组成. 后转移所有细胞至
6 孔板,添加
2 mL/孔12% FBS 的完全培养基, 置于 39℃、 5%CO2 的培养箱中培养. 电转后立即吸取少量细胞悬浮液进行台盼蓝染 色.细胞悬液与 0.4%台盼蓝溶液以 9:1 混合后加样 到一次性 Countess? 细胞计数板上.在3min 内使用 Countess? Ⅱ FL 全自动细胞计数仪(Life Invitrogen, 美国)分析细胞存活率. 电转
6 h 后更换成含有终浓度
100 U/mL 青霉素、
100 ?g/mL 链霉素、12% FBS 的DMEM 完全培养基 继续培养. 电转
48 h 后用 0.05%胰酶消化细胞,
1000 r/min 离心
5 min,添加
1 mL/孔PBS 重悬,利用荧 光激活细胞分选技术(fluorescence activated cell sorting, FACS)检测表达绿色荧光细胞数量,计算转 染效率(绿色荧光细胞数/总细胞数). 1.2.3 电转参数优化 ECM?
830 电转 PFFs 的最佳电转参数可借鉴 Ross 等[9] 研究结果(脉冲电压
300 V, 脉冲长度
1 ms, 脉冲次数
3 次), 而NEPA
21 和Nucleofector? 2b 电转PFFs 细胞的优化参数尚无报道. 为优化 NEPA
21 和Nucleofector? 2b 转染 PFFs 细胞的最佳参数, 本 研究首先将转染实验分为两个独立的处理组,即NEPA
21 组和 Nucleofector? 2b 组,每组设定
1 个 对应的空白组(仅添加
100 μL 相应体积的电转液和 水,不电转).根据电转仪 NEPA