PDF《鉴定和表达》

1 材料和方法 1.1 材料 Bbs I、 BamH I 限制性内切酶, T4DNA 连接酶购 收稿日期: 2010-09-27 基金项目: 国家自然科学基金(30972843) Supported by National Natural Science Foundation of China(30972843). 作者简介: 卢俊, 博士研究生, E-mail: 454921043@qq.com 通讯作者: 徐世元, 教授, 博士生导师,

电话: 020-61643298, E-mail: xushiyuan355@yahoo.com.cn 南方医科大学学报 (J South Med Univ) 2011;

31(1) ・ ・

86 自Takara 公司;

去内毒素质粒提取试剂盒, Taq 酶和 逆转录试剂盒购自美国Promega公司;

DMEM/F12培 养基、 Trizol、 Lipofectamine2000 转染试剂购自美国 Invitrogen 公司;

pGPU6/GFP/Neo 质粒购自上海吉玛 公司;

SH-SY5Y 细胞株购自中国科学院上海生命科 学研究院细胞资源中心;

DH5α菌种为本室保存;

AMPKα2和β-actin一抗购自Abcam公司. 1.2 方法 1.2.1 siRNA靶序列的设计 根据shRNA设计原则及 AMPKα2 (Gene bank: EF056019) cDNA序列, 使用美 国Ambion 公司在线设计软件(http://www.ambion. com/techlib/misc/siRNA_finder.Html) 设计针对AMPKα2 基因编码区序列中的

4 段序列(571~591, 1249~1269, 1303~1323, 1541~1561)为干扰靶序列. 正义链模板的 5'

端添加了 CACC, 与Bbs I 酶切后形 成的粘端互补;

反义链模板的 5'

端添加了 GATC, 与BamH I 酶切后形成的粘端互补;

shRNA 模板中的 loop 结构选用了 TTCAAGAGA 以避免形成终止信 号, shRNA的转录终止序列采用T6结构.序列如下: (1)Sense:5'

-CACCGCAGGTCCTGAAGTTGATATCTTC AAGAGAGATATCAACTTCAGGACCTGCTTTTTTG-3'

;

Anti-sense:5'

-GATCCAAAAAAGCAGGTCCTGAAGTT GATATCTCTCTTGAAGATATCAACTTCAGGACCTGC-3'

. (2)Sense:5'

-CACCGCTGAAGTTTACCGAGCTATGTTC AAGAGACATAGCTCGGTAAACTTCAGCTTTTTTG-3'

;

Anti-sense:5'

-GATCCAAAAAAGCTGAAGTTTACCGA GCTATGTCTCTTGAACATAGCTCGGTAAACTTCAGC-3'

. (3)Sense:5'

-CACCGCATACCATCTTCGTGTAAGATTC AAGAGATCTTACACGAAGATGGTATGCTTTTTTG-3'

;

Anti-sense:5'

-GATCCAAAAAAGCATACCATCTTCGT GTAAGATCTCTTGAATCTTACACGAAGATGGTATGC-3'

. (4)Sense:5'

-CACCGCTCTCTCACTGGCTCTTTGATTC AAGAGATCAAAGAGCCAGTGAGAGAGCTTTTTTG-3'

;

Anti-sense:5'

-GATCCAAAAAAGCTCTCTCACTGGCT CTTTGATCTCTTGAATCAAAGAGCCAGTGAGAGAGC-3'

. 划线部分为AMPKα2特异性序列.设计阴性对 照(NC)序列为: Sense:5'

-CACCGTTCTCCGAACGT GTCACGTCAAGAGATTACGTGACACGTTCGGA GAATTTTTTG-3'

;

Anti-sense:5'

-GATCCAAAAAATT CTCCGAACGTGTCACGTAATCTCTTGACGTGAC ACGTTCGGAGAAC-3'

.所有序列经使用BLAST和 相应的人基因组数据库进行比较, 排除同源性后提 交Invitrogen公司合成. 1.2.2 pGPU6/GFP/Neo-shRNA AMPKα2 真核表达载 体的构建 化学合成siRNA的正义链和反义链后, 分 别取5 μl 正、 反义寡核苷酸(终浓度均为10 μmol/L) ,

5 μl 10*退火缓冲液, 加入

35 μl 去离子水, 在PCR 仪 上按照如下程序进行退火处理: 95℃

5 min, 85℃

5 min, 75℃

5 min, 70℃

5 min, 4℃保存.退火处理后 得到浓度为

10 μmol/L 的shRNA 模板.将所得模板 溶液稀释

500 倍, 终浓度为

20 nmol/L, 用于连接反 应.将退火后的双链siRNA模板和pGPU6/GFP/Neo 载体于 22℃连接过夜.用连接产物转化感受态 E. coli DH5α, 在卡那霉素抗性平板上筛选重组质粒载 体, 扩增抗性菌落并提取质粒, 以BamH I、 Pst I 分别 酶切鉴定重组质粒.收集酶切鉴定为正确的重组质 粒, 提交Invitrogen公司进行DNA序列测定. 1.2.3 AMPKα2 shRNA质粒的细胞转染 用去内毒素 质粒提取试剂盒提取测序正确的各重组质粒和空载 质粒.DMEM/ F12 培养基, 15%胎牛血清, 5%CO2, 37℃恒温培养SH-SY5Y细胞, 待细胞生长良好时, 将SH-SY5Y 细胞按 5*105 /孔接种于