PDF《重组及表达》

12 g/ L 琼脂糖凝胶电泳检测. 1. 2.

7 重组质粒 pET28a( + )2CTLA242TCRV β

8 的构 建CTLA242TCRV β

8 目的基因片段和 pET28a ( + ) 质粒经 B am H Ⅰ 和Xho Ⅰ 双酶切后 ,回收酶切片段. 用T4 DNA 连接酶连接.连接产物转化 E. coli DH5 α, 提取质粒 ,双酶切及测序鉴定获得正确重组子. 1. 2.

8 融合蛋白的原核表达 将测序获得的正确重 组子转化 BL21 (DE3) 株.异丙基硫代半乳糖苷 (IPTG) 至终浓度

1 mmol/ L ,诱导表达

4 h ,离心收集 菌体.100 g/ L SDS2聚 丙烯酰 胺凝胶 电泳(SDS2 PA GE) 检测蛋白表达情况. 1. 2.

9 Western2Blotting 检测 将少量已诱导的工 程菌行 SDS2PA GE 电泳 ,然后在冰浴条件下将蛋白 转印至硝酸纤维膜上 ,小鼠 Anti2His Antibody 为一 抗,HRP2羊抗鼠 IgG 多克隆抗体为二抗 ,DAB 显色 检测目的蛋白并扫描记录实验结果.

2 结果2.

1 CTLA24 基因片段的获得 与预期结果相符合 的504 bp 条带(图1) . 图1PCR 扩增 CTLA24 基因片段 Fig.

1 Cloning CTLA24 gene by PCR

1 ,8 : DNA marker ;

2 -

6 : the PCR product of CTLA24 gene ;

7 : control group 2.

2 重组质粒 pcDNA3.

1 ( + )2CTLA24 的双酶切 鉴定 经Bam H Ⅰ 和EcoR Ⅰ 双酶切后 ,可得到 5.

4 kb 和504 bp 两个片段 ,证实为 CTLA24 插入 pcD2 NA3.

1 ( + ) (图2) . 2.

3 序列分析 经测序证实 ,质粒 pcDNA3.

1 ( + )2 CTLA24 中CTLA24 基因序列与文献[6] 报道的 CTLA2

4 胞外区 cDNA 序列一致 ,无碱基突变、 缺失和移码突 变 ,且外显子

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