PDF《鱼类肠道微生物总 DNA的提取》

1 0

0 , 上海天能仪器 厂) 检测照相.

1 .

3 .

4 肠道微生物总 D N A的16Sr D N A P C R扩 增参照 H u w s 等(

2 0

0 7 ) 的方法, 引物序列分别为: 上游引物: U

9 6 8-G C : C G C C C G G G G C G C G C C C C G G G C G G G G C G G G G G C A C G G G G G G A A C G C G A A G A A C C T T A C ;

下游引物:R

1 4

0 1 :C G G T G T G T A C A A G A C C C ;

委托上海生物工程公司合成.P C R扩 增体系

2 5μ L , 引物各

0 . 5μ L , 缓冲液

2 . 5μ L , 模板

0 . 5μ L , d N T P0 . 5μ L , T a q 酶0.5μ L以灭菌超纯水 补足

2 5μ L .反应条件:

9 5 ℃预变性 5m i n ,

3 5个循 环(

9 4 ℃、

2 0 s ;

5 6 ℃、

2 0 s ;

6 8 ℃、

4 0 s ) , 最后

6 8 ℃延伸 7m i n .

1 .

3 .

5 扩增产物检测 取PCR产物 5μ L经1%琼 脂糖凝胶电泳后, 用凝胶成像仪检测.

2 结果

2 .

1 肠道细菌总 D N A检测结果 4组样品的 D N A提取物经

1 .

5 %琼脂糖凝胶电 泳检测, 结果如图 1显示.空白对照组无条带, 各组 样品总 D N A在25k p左右, 每组样品条带明亮、 清晰、 整齐、 无降解现象, 提取效果较好.表明所提取 D N A样品溶液清亮, 可用于后续试验研究. C : 空白对照;

M :引物;

1~

4 :样品 图1鲫肠道微生物总 D N A琼脂糖电泳结果 C :C o n t r o l ;

M :M a r k e r ;

1~

4 :S a m p l e F i g .

1 A g a r o s eg e l e l c t r o p h o r e s i s o f t o t a l D N Af r o m C . a u r a t u s i n t e s t i n a l t r a c t b a c t e r i a

2 .

2 P C R扩增产物检测结果 以提取得到的细菌总 D N A作为模板, 进行 P C R 扩增, 如图 2所示.由细菌通用引物扩增出的各组 D N A样品

1 6 Sr D N A特异性较好, 大小在

4 5 0b p左右, 显示图谱清晰, 扩增效果较好.

3 讨论 鱼类肠道微生物区系在其健康方面扮演非常重 要的角色.因此, 调控鱼类消化道微生物区系对提 高鱼类的生产性能和饲料利用率, 减少病原菌在肠 道内的定植具有重要的意义.

9 1

1 2

0 1 0年第 3期 汪明等, 鱼类肠道微生物总 D N A的提取 M :引物;

1~

4 :P C R产物 图2PCR产物琼脂糖电泳结果 M :M a r k e r ;

1~

4 :P C Rp r o d u c t F i g .

2 T h ea g a r o s eg e l e l c t r o p h o r e s i s o f P C Rp r o d u c t s 肠道正常菌群常用的研究方法是传统的细菌纯 培养法, 然后通过生理生化性状、 特定的表型进行分 析, 但以上方法都局限于从培养基中分离得到微生 物.随着分子生物学技术的发展, 纯培养日益显出 局限性: (

1 ) 自然界很多微生物不能人工培养;

(

2 ) 绝大多数严格厌氧微生物尚未得到鉴定和描述;

(

3 ) 人为培养的微生物与其自然界菌体在形态和特 征上差异显著( 冯仰廉,

2 0

0 4 ) .例如: 水环境中的 可培养菌低于

1 %, 鱼体表的可培养微生物更不足

0

0 1 %, 淡水鱼半数肠道细菌即使通过不同培养基 及不同培养条件仍然无法培养( S u g i t ae t a l ,

1 9

8 5 ;

B e r n a d s k y&

R o s e n b e r ,

1 9

9 2 ;

A m a n ne ta l ,1

9 9

5 ) . 由此不难推断, 常规培养法无法获取鱼类消化道菌 群的全面信息, 并且在时间和金钱上消耗比较大. 随着科技的发展, 大量分子生物学技术应用于肠道 微生物态学的研究中, 但多数研究还是还沿用传统 的DNA制备方法提取肠道微生物总 D N A ;

该技术 不仅步骤复杂, 而且样品需要量大, 难以快速处理大 量标本.相对于人、 反刍动物和一般的家畜而言, 水 产动物肠道短而结构简单, 所能取得的肠道微生物 D N A样品较少, 因而传统的 D N A制备方法不适用 于水产动物肠道微生物多态性的研究. 在本实验过程中, 采取多种方法去除杂质和抑 制物, 如在细菌裂解前使用无菌 P B S对样品进行反 复清洗、 差速离心, 去除样品中较大的颗粒杂质;