PDF《荧光WB实验方案及如何使用二抗》

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了解如何使用IRDye?二抗,封闭,抗体稀释,孵育时间,洗涤步骤和成像以获 得荧光免疫印迹中清晰的条带. 应用IRDye?? 二抗的荧光蛋白印迹是可以定量的,并且提供比基于酶的方法更宽的动态范围,使其成为 量化相对蛋白质丰度的最佳选择.? 有关样品制备,运行凝胶以及将凝胶中的蛋白质转移至膜上的指导, 请参阅我们的常规western?blot方案. 封闭与一抗孵育 ? 将膜浸没在高质量的TBSbased 封闭缓冲液(BB).孵育1小时. ? 使用稀释液(50%BB,50%TBS0.1%吐温20(TBST))稀释抗体. ? 将膜浸没在10ml配好的一抗孵育液中,放在摇床上孵育.建议使用浓度梯度时间梯度来确认最佳 稀释比例和孵育时间. 洗膜并准备二抗 ? 去除一抗孵育液并开始洗涤步骤. ? 洗膜液使用 TBST,先快速冲洗2次,然后充分洗膜3次,室温,每次15分钟. ? 洗膜时,配置二抗孵育液,根据建议(见下表1)稀释二抗.确保二抗孵育液充分混匀. 荧光二抗 都是光敏感的,孵化时应避光. ? 去除TBST并孵育二抗,放置在摇床上,避光孵育1小时. ? 孵育后,去除二抗孵育液,重复第2步的洗膜步骤. 表1:二抗与稀释度 一抗宿主物种 货号 二抗名称 建议稀释比例 abcam 2018-03-21 abcam 此为临时链接,仅用于预览,将在短期内失效. 阅读原文 Rabbit ab216773 Goat anti-Rabbit IgG H&L (IRDye ? 800CW) preadsorbed 1:10,000 ab216777 Goat Anti-Rabbit IgG H&L (IRDye ? 680RD) 1:10,000 Mouse ab216772 Goat anti-Mouse IgG H&L (IRDye ? 800CW) preadsorbed 1:10,000 ab216776 Goat anti-Mouse IgG H&L (IRDye ? 680RD) preadsorbed 1:10,000 查看其它IRDye?抗体 成像 ? 使用无绒棉布沾取70%乙醇清洁扫描区. ? 如果扫描干燥的膜,将膜放在两张滤纸之间,并用箔片覆盖,在工作台上放置过夜.将蛋白面朝下 放置在扫描区,膜上方压上硅胶垫,以确保膜平放在玻璃上.不需要滚筒. ? 如果扫描湿润的膜,则蛋白面朝下放置在扫描区,滴取5ml TBST覆盖整个扫描区.在膜上放置硅 垫,用滚筒去除气泡. 组蛋白检测用湿膜扫描效果很好. ? 盖上设备,根据设备使用说明进行相应的扫描.扫描后,将膜取下,并使用无绒棉布沾取70%乙 醇清洁扫描区. 此为临时链接,仅用于预览,将在短期内失效.