PDF《东理工大学学位论文》

7 1.5 常见的乙醇路径.9 1.6 课题研究的意义与内容.12 第2章材料与方法.14 2.1 实验材料.14 2.1.1 菌株与载体.14 2.1.2 主要试剂.14 2.1.3 实验仪器.15 2.1.4 培养基,主要溶液的配制.15 2.2 实验及分析方法.17 2.2.1 基因组 DNA 的提取

17 2.2.2 PCR 扩增

17 2.2.3 目的基因的克隆.19 2.2.4 表达系统的构建.21 2.2.5 基因 pdc 和adhB 活性的定性检测.21 2.2.6 Red 重组

22 华东理工大学硕士学位论文 第IV 页2.2.7 SDS-PAGE.24 2.2.8 酶活的测定.24 2.2.9 发酵条件.25 第3章实验结果.26 3.1 基因 pdc-adhB 的克隆

26 3.1.2 乙醛指示平板.27 3.1.3 蛋白质电泳.28 3.2 Red 重组

29 3.2.1 重组相关质粒的构建.29 3.3.2 Red 重组

30 3.4 重组菌 E. coli P81(pUC19-bglB)的构建.31 3.5 重组菌 E. coli P81(pUC19-bglB)的酶活测定

31 3.5.1 乙醛指示平板定性检验.31 3.5.2 重组菌 E. coli P81(pUC19-bglB)的AdhB 酶活测定.32 3.5.3 胞外酶活测定.32 3.6 纤维二糖为碳源的乙醇发酵.33 3.6.1 以纤维二糖为唯一碳源的发酵.33 3.6.2 重组菌 E. coli P81(pUC19-bglB)发酵纤维二糖生产乙醇.34 3.6.3 纤维二糖的浓度对发酵的影响.36 3.6.4 葡萄糖对纤维二糖代谢的影响.38 第4章讨论与展望.40 参考文献.41 致谢.46 华东理工大学硕士学位论文 第V页前言 当今社会,由于人口的膨胀和社会的迅猛发展,日益严峻的能源短缺和环境问题是 国际社会存在的普遍问题,正在困扰或者威胁着许多国家的发展.而另一方面,木质纤 维质具有来源广泛、可再生、成本低的优点,是唯一能够连续生、规模可控、可存储、 可运输的全能性能源,但利用率却不高,对环境也造成了一定的污染,因此,利用木质 纤维质生产可再生能源的研究和开发成为了热点问题.其中,生物乙醇由于其具有高热 值、燃烧充分、改善燃油品质等被液体能源产品所期望的特性而倍受青睐,同时它还具 有易降解、方便安全运输、可再生和含硫量低等环境友好的特性,是非常理想的化石燃 料的未来替代品.然而,制约生物乙醇工业应用和大规模生产的主要问题是成本问题, 而其中的纤维素酶的成本占据了很大部分,有时可达成本的二分之一. 为了增加单位产值,降低成本,减少来自添加纤维素酶的成本,人们探索将纤维素 酶的生产、纤维素的水解和水解产物发酵整合于一步,即通过乙醇发酵 CBP 工艺来处 理木质纤维质,而具备这三个功能的发酵菌种被称之为整合生物加工菌种.大肠杆菌遗 传背景清楚,繁殖快,基因操作成熟,所以选用大肠杆菌为构建乙醇发酵 CBP 菌株的 出发菌株,通过将能够分泌超表达纤维素酶基因转入所选菌种,将纤维素酶分泌表达到 体系中,完成 CBP 工艺. 本课题首先在大肠杆菌中构建了高效产乙醇路径.通过 Red 重组,将运动发酵单胞菌 Zymomonas mobilis ZM4 的丙酮酸脱羧酶基因 pdc 和乙醇脱氢酶基因 adhB 整合到大肠杆 菌JM109 基因组,命名为 E. coli P81.之后又在前一步构建所得的重组菌内,引入 β- 葡萄糖苷酶基因,使其可以代谢纤维二糖.克隆了对纤维二糖底物具有较高专一性的多 粘芽孢杆菌(Bacillus polymyxa) β-葡萄糖苷酶基因 bglB 到E. coli P81, 构建了一株能够分 泌β-葡萄糖苷酶到胞外的的重组菌, 实现了纤维二糖为碳源进行乙醇发酵的整合生物加 工.为今后得到实用的纤维素酶分泌表达型的乙醇发酵 CBP 工程菌提供了研究基础. 华东理工大学硕士学位论文 第1页第1章文献综述 1.1 生物乙醇概述 1.1.1 开发生物乙醇的意义 随着当今世界人口的迅速不断扩张和产业的繁荣增长,全球对各种自然资源的需求 不断增长,主要的能源需求仍然是传统的化石燃料,如石油,煤和天然气[1] .专家预计 全球可供开采的石油储备会在未来的