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共聚焦激光扫描荧光显微镜 ― 基本原理、应用及样本制备原则 宋健武汉大学医学院结构生物学研究中心 Centre for Structural Biology Wuhan University School of Medicine 生物秀实验频道――生命科学实验中心 www.

bbioo.com/bio101 生物秀论坛――学术交流、资源共享、互助社区 www.bbioo.com/bbs 什么是共聚焦激光扫描荧光显微镜? 共聚焦激光扫描荧光显微镜(Confocal Laser Scanning Fluorescence Microscope;

LSFM) ? 以激光作为激发光源,采用光源针孔与检测针孔共轭 聚焦技术,对样本进行断层扫描,以获得高分辨率光学切片的 荧光显微镜系统 共聚焦系统 ? 细胞CT 生物秀实验频道――生命科学实验中心 www.bbioo.com/bio101 生物秀论坛――学术交流、资源共享、互助社区 www.bbioo.com/bbs 荧光和荧光显微镜

一、荧光的基础术语 荧光物质: 某些物质在特定波长范围内的光线照射下,可发 出波长比照射光长的光线 ― 荧光.受激发后能 产生荧光的物质称荧光物质或荧光素 激发光(EXCITATION): 能特异性地激发某种荧光素的一定波长范围内的 光线称为该荧光素的激发光.激发/吸收光谱;

吸 收波峰(最大吸收波长) 488nm 520nm 异硫氰酸荧光素(FITC) 发射光(EMISSION): 发射光谱;

发射波峰(最大发射波长) 荧光探针: 能产生荧光的特异性生物染料(PI, Dapi)、标有荧光素的特异性蛋白结合物(荧光抗体) 自发荧光(AUTOFLUORESCENCE): 组织或细胞中的某些成份受激发时可发出荧光―自发荧光. 伊文斯蓝、硼化氢钠处理 漂白(BLEACH): 荧光物质受激发时,其发射荧光的能力逐渐下降并最终丧失 ― 漂白. 生物秀实验频道――生命科学实验中心 www.bbioo.com/bio101 生物秀论坛――学术交流、资源共享、互助社区 www.bbioo.com/bbs

二、荧光显微镜术的基本原理 荧光显微镜 激发滤镜:从光源中分滤出一定波长范围的激发光. 带通滤色镜(BP):有宽、窄带之分.如:BP450-490 长、短通滤色镜组合(LP + KP):LP450 + KP490 双色镜:双色分光镜;

反射短波长,透过长波长. 阻断滤镜:多为长通滤色镜;

LP490 紫外 蓝绿高压汞灯被荧光 探针染 色的生 物样本 激发 被标记 结构的 荧光光 学图像 光学 成像 滤镜 分光 488nm 520nm FITC 450nm 490nm 生物秀实验频道――生命科学实验中心 www.bbioo.com/bio101 生物秀论坛――学术交流、资源共享、互助社区 www.bbioo.com/bbs 共聚焦激光扫描荧光显微镜基本配置 Laser and electronic Control Unit 激光光源及 控制装置 Computer 计算机 Confocal scan and detector unit 共聚焦扫描及检测装置 Microscope 荧光显微镜 Anti- vibration table 防震台 Leica TCS SP-2 MP AOBS Confocal System 生物秀实验频道――生命科学实验中心 www.bbioo.com/bio101 生物秀论坛――学术交流、资源共享、互助社区 www.bbioo.com/bbs 共聚焦装置 光源 针孔 检测 针孔 荧光显微镜 光电倍增管 步进聚焦电机 物镜 Bio-Rad LaserSharp 系统操作,图像处理 3-D重建 X/Y扫描 装置 生物秀实验频道――生命科学实验中心 www.bbioo.com/bio101 生物秀论坛――学术交流、资源共享、互助社区 www.bbioo.com/bbs 光电倍增管 检测针孔 光源针孔 光源 分色镜 物镜 样本 聚集平面 共聚焦扫描显微镜光学原理 检测针孔和光源针孔始终聚焦于同一 点,使聚焦平面以外被激发的荧光不能进 入检测针孔 ? 高分辨率的光学切片 激光穿透性强,可对样本进行一定深 度光学断层,获得高标准的连续光学切片 ? 实现三维重建 生物秀实验频道――生命科学实验中心 www.bbioo.com/bio101 生物秀论坛――学术交流、资源共享、互助社区 www.bbioo.com/bbs 生物秀实验频道――生命科学实验中心 www.bbioo.com/bio101 生物秀论坛――学术交流、资源共享、互助社区 www.bbioo.com/bbs 三维胶原基 质培养的血 管平滑肌细 胞 三维胶原基 质培养的血 管平滑肌细 胞 生物秀实验频道――生命科学实验中心 www.bbioo.com/bio101 生物秀论坛――学术交流、资源共享、互助社区 www.bbioo.com/bbs 共聚焦激光扫描荧光显微镜应用领域 只要目的结构是用荧光探针标记的,都可 用共聚焦激光扫描荧光显微镜观察. 形态学研究:细胞凋亡、中枢神经系的F联系、肿瘤细胞分类…… 分子生物学:原位杂交,DNA、RNA定量, DNA损伤修复、外源性基因在真核细胞的表达、 定位,荧光能量共振转移→大分子构象的改变 、受体与配体相互作用…… 活细胞动态荧光测量:细胞内Ca++、K+、H+ 等离子的动态分布及动态定量、荧光漂白恢复 →细胞连接间的信息沟通…… 直接对活组织或整体胚胎观察:单光子共 聚焦激光扫描系统的局限性:荧光漂白 生物秀实验频道――生命科学实验中心 www.bbioo.com/bio101 生物秀论坛――学术交流、资源共享、互助社区 www.bbioo.com/bbs Intensity Before bleach After bleach

90 min after bleach 1. 荧光漂白恢复 (Fluorescence Recover after photobleaching;

FRAP) 检测细胞连接间的信息传递 生物秀实验频道――生命科学实验中心 www.bbioo.com/bio101 生物秀论坛――学术交流、资源共享、互助社区 www.bbioo.com/bbs

2 . 荧光能量共振转移(Fluorescence Resonance Energy Transfer) I.荧光能量共振转移: 受激态荧光素将其能量向另一个荧光素传递,使 后者被激发,这一过程称荧光能量共振转移.能量的提供者叫供体荧光 素,能量的接受者叫受体荧光素. 供体荧光素 受体荧光素 1.供体与受体间的距离