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网址:www.yeasen.com 第1页,共3页HieffTM qPCR SYBR? Green Master Mix (Low Rox) 产品信息 产品名称 产品编号 规格 储存 HieffTM qPCR SYBR? Green Master Mix (Low Rox) 11202ES03

1 ml (40rxn(25? l/rxn)) -20℃避光 HieffTM qPCR SYBR? Green Master Mix (Low Rox) 11202ES08 5*

1 ml (200rxn(25? l/rxn)) -20℃避光 产品描述 HieffTM qPCR SYBR? Green Master Mix 是2* 浓缩的实时定量 PCR 扩增的预混合溶液,专为高特异性、高灵敏度实时定 量PCR 而设计.Mix 中含有热启动的 HieffTM DNA Polymerase,SYBR? Green I,dNTP Mix,Mg2+ .使用时仅需在扩增体系 中加入模板和引物即可进行实时定量 PCR,大大简化操作过程,缩短操作时间,降低污染.同时,反应体系中添加了 Rox 内参染料,可校正不同孔间的荧光信号误差.可以有效抑制非特异性的 PCR 扩增,从而显著提高 PCR 反应的扩增效率,使 定量 PCR 可以在宽广的定量区域内获得良好的线性关系. 本产品与绝大多数厂商的实时荧光定量PCR 仪兼容, 如ABI 7500,

7500 Fast Real-Time PCR System, ViiATM

7 和Stratagene MX3000P,MX3005P,MX4000 等. 产品组分 组分 产品编号/规格 11202ES03(1 ml) 11202ES08(5*1 ml) HieffTM qPCR SYBR? Green Master Mix

1 ml

1 ml*

5 50*Low ROX

40 μl

200 μl 适用机型 本产品中含有用以校正孔与孔之间产生的荧光信号误差的低浓度 ROX Reference Dye,适用于以下荧光定量 PCR 仪: ABI 7500,7500 Fast Real-Time PCR System,ViiATM

7 Stratagene MX3000P,MX3005P,MX4000 其他需要添加低浓度 ROX Reference Dye 的荧光定量 PCR 仪 储藏与使用期限 本产品应置于-20℃避光储存;

尽量避免反复冻融,如每次使用量较少,推荐小份分装使用,有效期半年. 操作流程 1.上下颠倒混匀 Mix,避免剧烈震荡以免产生过多气泡.Mix 轻微离心后即可使用. 2.qPCR 反应体系配制 试剂 体积 1(50 μl) 体积 2(20 μl) HieffTM qPCR SYBR? Green Master Mix

25 μl

10 μl Primer 1(10 μM)

1 μl 0.4 μl Primer 2(10 μM)

1 μl 0.4 μl 50*Low ROX

1 μl 0.4 μl 模板 DNA X μl X μl 无菌蒸馏水 Up to

50 μl Up to

20 μl 注:反应体系中各成分的量可根据以下原则自行调整: 上海翊圣生物科技有限公司 客服热线:4006-111-883 E-mail: order@yeasen.com

网址:www.yeasen.com 第2页,共3页1) 反应体系中引物浓度一般在 0.1-1.0 μM 之间,一般引物终浓度为 0.2 μM 扩增效果较好;

2) cDNA 模板的体积不要超过反应体积的 1/10;

3) 扩增产物长度请选择在

100 bp-500 bp 范围内,尤其推荐

100 bp-200 bp 之间;

4) qPCR 灵敏度极高,建立反应体系时加入模板量的准确程度对最终定量结果会有很大的影响. 因此如仪器允许,推荐您 使用

50 μl 反应体系,并且将模板稀释后(如稀释至

5 μl/样本)加入反应体系中, 这样可以有效提高实验的重复性. 3.qPCR 反应条件 本实验以两步法程序为例,即退火/延伸设置在 60℃.也可以用三步法进行 PCR 扩增反应. 注意:HieffTM DNA Polymerase 需要热激活处理以恢复酶活性,请至少设置 PCR 反应预变性条件为 95℃

5 分钟.如果模板 中GC 含量较高,可将预变性时间延长至

10 分钟. 95℃

5 min 预变性 95℃

10 sec 循环反应(40 cycles) 60℃

34 seca 95℃

15 sec 融解曲线 b 60℃

60 sec 95℃

15 sec 注:a: 延伸时间需要根据定量 PCR 仪所需要的数据采集最短时间限制自行调整,使用 ABI

7500 设定为

34 sec. b: 融解曲线采集程序可根据您使用的 Real Time PCR 仪自行调整,通常情况下使用仪器默认程序即可. 4.反应结束后确认 Real Time PCR 的扩增曲线(图一)及融解曲线(图二),进行标准曲线制作等.也可用琼脂糖凝胶电 泳确认 PCR 扩增产物特异与否. 图一 扩增曲线 注:对于荧光定量而言,反应 Ct 值落在 20-28 之间定量最为准确.如果 Ct 值太小,请稀释模板后重新进行试验;

Ct 值大于

35 时,Real Time PCR 检测无效,目标基因无表达;

当Ct 值介于 32-35 之间时,需要至少三个重复才能判断目标基因是否 表达. 图二 扩增产物融解曲线 上海翊圣生物科技有限公司 客服热线:4006-111-883 E-mail: order@yeasen.com 本产品仅作科研用途! 第3页,共3页注:如果反应特异性好,无非特异性扩增产物产生,无引物高级结构,则融解曲线应该是单峰曲线,此时定量结果有效;

若 融解曲线出现显著多峰,则定量结果无效,请优化条件重新进行定量实验.(引物设计不合理而导致的引物二聚体在融解曲 线内峰值一般位于 75℃左右,如该峰显著请更换引物再次实验). 使用本品进行绝对定量需自行绘制标准曲线;

进行相对定量可根据下述公式计算目标基因表达情况: 设定 CtA1 为1号样本目标基因 Ct 值,CtB1 为1号样本内参基因 Ct 值;

CtA2 为2号样本目标基因 Ct 值,CtB2 为2号样本内 参基因 Ct 值,则1号样本和

2 号样本目标基因表达水平比值可粗略计算为(2-Ct 法): Ct =(CtA2 -CtB2 )-(CtA1 -CtB1 )= X 则2号样本内目标基因的表达水平为

1 号样本内的

2 -X 倍. 注: 上述计算方法是假定扩增效率为 100% (每个循环过后产物量为前一循环产物量乘以 2), 如实际过程中扩增效率不为 100%, 需根据实际扩增效率修改计算公式.例如:目标基因和内参基因扩增效率为 0.90,则计算公式应该修正为(1+0.90) -Ct . 引物设计指南 1) 扩增产物长度 100bp-150bp 为佳.重要! 2) 引物长度

17 bp-25 bp 最好.太短的引物容易导致扩增效率降低,太长的引物会导致引物高级结构出现几率增加;

3) 引物的 3'端应尽量避免高 GC 或高 TA 含量区域;

4) 引物 3'端最后一个碱基最好为 G 或者 C,避免使用 T;

5) 正向引物和反向引物的 Tm 值最好相差不要超过 1℃.Tm 值调整至 60℃-65℃为佳.(引物 Tm 值推荐使用 Primer

5 进行计算). 6) 引物的 GC 含量控制在 40%-60%之间,最佳为 45%-55%;

7) 引物 A、G、C、T 整体分布尽量要均匀,避免使用 GC 或者 TA 含量高的区域,尤其是 3'端,必须避开 GC 含量不均 匀的区域;

8) 尽量避开 T/C 或者 A/G 的连续结构;

9) 避开引物内部或者两条引物之间有

3 个碱基以上的互补序列,二条引物之间的 3'端避开有

2 个碱基以上的互补序列;

10) 引物设计完毕使用 NCBI BLAST 功能检索核对引物特异性,以避免非特异性扩增产生. qPCR 反应有效性确认标准 1) 线性关系以及扩增效率确认: 标准曲线相关系数(R2 )>0.98 标准曲线斜率介于 -3~-3.5 之间 PCR 扩增效率(E)介于 0.9~1.2 之间 2) 重复性确认: 重复管之间的 STD